Господин Свещаров
Биологичен калейдоскоп (21)

Най-новите постижения на съветската биохимия и молекулярна биология. Съветските генни инженери конструират „нови“ микроорганизми. Българският принос за разгадаване химията на живота

Ако се замислим малко по-сериозно, вероятно ще се съгласим, че заглавия, подобни на това от настоящата глава на книгата, само преди двадесетина години биха били по-подходящи за научнофантастични разкази. Революцията в биологията обаче скъси толкова много времето за реализиране на научните разработки в областта на молекулярната биология, биохимия и генетика, че, казано образно, днешните мечти утре се превръщат в реалност. Независимо от това, учените продължават да проникват още по-дълбоко в тайнствения свят на клетката и се стараят да разгадаят докрай сложните механизми, които управляват дейността на биополимерите в нея.

Наскоро с постановление на ЦК на КПСС и Министерския съвет на СССР беше присъдена Държавна награда в областта на науката и техниката на академик Юрий Анатолиевич Овчинников — директор на Института по биоорганична химия „М. М. Шемякин“, на член-кореспондент Роман Бениаминович Хесин-Лурие — завеждащ лаборатория в Института по молекулярна генетика при АН на СССР, и на група сътрудници за разработка на тема, озаглавена „Структура и генетика на РНК-полимеразата“.

За да бъде по-ясна на нашите читатели същността на тази научна разработка, искам да им припомня, че наследствената информация на даден организъм е записана в молекулите на дезоксирибонуклеиновата киселина — ДНК, под формата на код, чиято същност се заключава в последователността на подреждането на нуклеотидите, изграждащи самата ДНК. Разчитането на тази информация става на два етапа. В първия един от най-сложно устроените клетъчни ензими — РНК-полимеразата, „прочита“ закодираната информация в ДНК, като едновременно с „прочитането“ я „превежда“ на друг език и се синтезира една рибонуклеинова киселина, наречена информационна (или РНК-посредник), която отнася матрицата за синтеза на определени белтъци в рибозомите — клетъчните „фабрики“ за белтък. Или казано с други думи, наследствената информация в клетката се предава по схемата ДНК–РНК–белтък.

Ясно е, че значението на ензима РНК-полимераза има изключително голямо значение за клетъчното стопанство. За да могат изследователите да наподобяват процесите, извършващи се в живата клетка, и да осъществят някои изкуствени биосинтези, пред изследователските колективи беше поставена трудната задача за установяване цялостната структура на този ензим и да се проучи генетиката й. РНК-полимеразата е голям и сложно устроен белтък, изграден от няколко субединици. За да се получи представа за мащабите на поставената задача, е достатъчно само да кажем, че общата дължина на полипептидните вериги от всички субединици на РНК-полимеразата надвишава 3000 аминокиселини.

Разбира се, биохимиците не започваха изследванията си от самото начало — още през 1953 година английският биохимик Ф. Сангер определи структурата на инсулина. Той е един сравнително малък белтък, изграден от „само“ 51 аминокиселини. За щастие от това време до наши дни техниката в биохимичните изследвания беше вече направила голяма крачка напред.

И така, с трудната задача за разгадаване структурата и генетиката на РНК-полимеразата се зае и колективът от учени, оглавяван от видния съветски учен акад. Юрий Овчинников. Съветските специалисти си изработиха за целта научна стратегия, която се състоеше в това, че при анализа на белтъка беше определяна структурата само на отделните му фрагменти. Едновременно с това те правеха пълен анализ на гените, кодиращи този белтък, което им позволяваше въз основа на познанията за генетичния код да си създават отлична представа за всички полипептидни вериги. Със съществуващите за целта методи генният анализ можеше да се прави много по-бързо (отколкото анализа на белтъците), но много лесно бе и да се допусне грешка. Дори и една единствена неточност, например пропуск на един нуклеотид, можеше да доведе до съвсем погрешен извод за структурата на белтъка. Избраният от съветските учени метод обаче им даваше възможност да проконтролират щателно всяка допусната грешка, като предполагаемата структура на белтъка е била съпоставяна със структурата на отделните му фрагменти, получени при непосредствения анализ.

Едновременно със съветските учени няколко научни колектива от САЩ и Западна Европа също си бяха поставили задачата да разгадаят структурата на РНК-полимеразата. В благородното съревнование победа удържаха съветските специалисти, които не се стреснаха от именитите си съперници, благодарение на което успяха да разкрият структурата на голямата ензимна молекула. Както може да се предположи, успехът на съветските учени беше подходящо оценен в научните кръгове от цял свят. Той стимулира много други изследвания, които се базираха на данните за структурата на РНК-полимеразата както в СССР, така и в редица други страни.

Но работата, свързана с отделянето и изучаването свойствата на изолираните молекули РНК-полимеразата, всъщност представляваше само първия етап от работата на съветските учени. Крайната задача бе да се открие механизмът на действие на ензима и всичките му клетъчни взаимовръзки. В цялостното решаване на задачата много голяма роля изигра разработката, която бе свързана с генетиката на РНК-полимеразата. Колективът на чл.-кор. Хесин-Лурие се зае с изследването строежа на мутантните форми на ензима и успя да открие къде се намират уврежданията в молекулата на мутантния ензим, т.е. установиха разликата му от нормалния ензим. С това колективът постави крайъгълния камък в изследванията на взаимовръзката между структурата и функциите на РНК-полимеразата.

Изследванията върху РНК-полимеразата, направени от съветските учени, макар и да имаха фундаментален характер, т.е. чисто научни, впоследствие оказаха извънредно голямо влияние върху развитието на методите на генното инженерство в СССР. За тях известният съветски биохимик академик А. А. Баев каза много сполучливо, че са крачка от днешния към утрешния ден. Затова в Съветския съюз, както и в целия свят, през последните години на развитието на молекулярната биология и генетика се отделя огромно внимание. Изследванията в тези области получиха не само много висока оценка, но и значителна подкрепа в постановленията на ЦК на КПСС и Министерския съвет за „Мерките относно ускореното развитие на молекулярната биология и молекулярната генетика и използване на постиженията им в народното стопанство“ (1974 г.) и „За развитието на физикохимическата биология и биотехнология и за използване на техните постижения в медицината, селското стопанство и промишлеността“ (1981 г.). Вниманието към тези науки, които доскоро бяха чисто теоретични, съвсем не е случайно. Благодарение на тях се роди генното инженерство, с чиито методи днес се получават от микроорганизми евтини биологичноактивни вещества, извънредно важни за медицината, селското стопанство и хранителната промишленост.

Искаме да ви разкажем и за едно друго изследване, извършено във Всесъюзния научноизследователски институт по генетика и селекция на промишлените микроорганизми. Известно е, че аминокиселината треонин присъствува в списъка на недостигащите на селскостопанските животни незаменими аминокиселини. Години наред микробиолози от различни страни се мъчеха с методите на класическата генетика и селекция да намерят подходящ почвен микроорганизъм, който наред с повишената си продукция от лизин и глутаминова киселина да започне да синтезира треонин в промишлени условия. Тези опити оставаха без успех до момента, когато специалистите от института не решиха „да възложат“ тази дейност на бактериите от вида Ешерихия коли.

На учените беше известно, че процесът на биосинтеза на треонина в микроорганизмите протича през няколко последователни химични реакции, всяка една от които се катализира от специален ензим. „Рецептата“ за тяхното производство е записана в гените на микроорганизма. Системата за биосинтеза в клетката работи извънредно икономично, тя не прави нищо излишно. На изследователите беше известно, че в случая тя действува по следния начин: ако в клетките на коли-бактериите се появи дори нищожен излишък от треонин, той моментално започва да въздействува върху един от ензимите, които участвуват в метаболитните реакции, и неговата активност и по-нататъшна биосинтеза значително се забавят. При още по-голям излишък от въпросната аминокиселина дейността на гените, които имат отношение към биосинтезата на треонина, се блокира и процесът на синтезата му се прекратява.

Ясно е, че за да бъдат накарани клетките на бактериите Е. коли да произвеждат по-големи от необходимите им количества аминокиселина, трябваше да бъде изключен механизмът, регулиращ нейната синтеза. За целта обикновено се прибягва към създаване на мутантни форми коли-бактерии. Върху тях се въздействува със силни дози радиации или с химични вещества, за да се измени наследствената информация в хромозомите в желаната от хората насока. На пръв поглед тази дейност може би изглежда елементарно лесна, но в действителност това не е така. Преди известно време опитите за хромозомни мутации много сполучливо бяха сравнени с желание да се поправи телеграфен текст върху лентата с помощта на бояджийска четка. Дори нещо повече — телеграфната лента е омотана на кълбо и действието се извършва на тъмно! Тъй че при облъчването на бактериите милиони загиват и остават само единици, в които е предизвикана желаната мутация. Специалистите от споменатия институт все пак успели да получат мутантни коли-бактерии, в които един от необходимите гени бил „повреден“ така, че престанал да „забелязва“ излишните количества треонин. Но това била само първата стъпка. Следващата била да принудят коли-бактериите да намалят разхода на аминокиселини за собствени нужди, като били нанесени допълнителни корекции върху системата за общата регулация. Треонинът започнал да се натрупва в мутантните клетки, но от гледна точка на производството той все още бил в нищожни количества. Следващата стъпка била да се „надари“ новият щам със способността да изработва „хормон на опасността“ — алармон. Под негови команди в клетките на микроорганизмите бил въведен строг режим на икономии, но биосинтезата на аминокиселини рязко се засилила.

Бактериите започнали да произвеждат и отделят в културалната среда до 2–3 грама треонин на литър. Този резултат все още не бил достатъчен за промишлено производство, но изследователите били доволни. Те вече добре познавали своите „питомци“ и можели да продължат манипулациите си върху тях. Сега те приложили към тях общото правило за „дозата на гена“. То се изразява в това, че ако в хромозомите на даден вид една и съща инструкция се повтаря няколко пъти, изработването на съответния продукт значително се повишава. За целта било прибягнато до извънредно фини и деликатни „операции“ върху хромозомата на коли-бактерията. С помощта на остроумни биохимични методи, с невероятна точност, за да не се повреди нито една „буква“ от генетичната информация, била извлечена групата гени, отговорни за биосинтезата на треонина. След това тези гени били „пришити“ към специално подготвени плазмиди. Поставили ги в епруветки, населени с милиарди коли-бактерии, и прибавили „за апетит“ специални вещества. Достатъчно било само една единствена бактерия да погълне хибридния плазмид — вътре в клетката й той веднага ще създаде 15–20 свои копия. Така бил получен нов щам коли-бактерии, който произвеждал вече 20 грама треонин на литър културелна среда.

Радостта на изследователите обаче не траяла дълго време. Скоро те разбрали, че новополученият щам бързо губи рекордните си показатели. Проведените прецизни изследвания показали, че при деленето получените дъщерни клетки не винаги получават и от хибридните плазмиди. Броят на „празните“ бактерии в културата започвал да преобладава и количеството на отделяния треонин падало катастрофално. В този критичен момент учените прибягнали до един извънредно хитроумен ход — те внедрили на бактериите още един ген, в който бил кодиран сигнал за „самоубийство“, ако при деленето тя останела без плазмид. С въвеждането му щамът стабилизирал продуктивността си.

Радостта и чувството на законна гордост у изследователите обаче били попарени от икономистите и производствениците: те не били доволни от икономическите показатели на създадения с толкова труд и перипетии щам. Защото той можел да съществува само ако се отглежда в разтвори на глюкоза и фруктоза, които са доста по-скъпи от захарозата. Отново започнал упорит труд: от други бактерии, обитаващи стомашно-чревния тракт на животните и добре усвояващи захарозата, били извлечени съответните гени и присадени в коли-бактериите. Изследователският колектив вече бил натрупал богат опит, в резултат на който извършената генноинженерна операция преминала изключително успешно. Когато били подбрани най-оптималните условия за съществуване на няколкократно прекроявания бактериален щам, той започнал да произвежда дори 30 грама треонин на литър среда, и то при един много къс цикъл, протичащ за около 30 часа. Най-после учените можели да си отдъхнат, защото всички качества на техните бактерии задоволявали производителите и икономистите.

Ако се опитаме да направим едно обобщение на описаната научноизследователска дейност, можем да кажем, че успехите са двупосочни: за пръв път в света беше създаден промишлен бактериален щам от коли-бактерии, който синтезира треонин. Той беше създаден от съветските специалисти за рекордно къс срок — около 3 години, като за пръв път са били използвани редица нови методи за генно реконструиране. От друга страна, изходните коли-бактерии били вече толкова „прекроявани“, че загубили някои от най-характерните особености на собствения си щам. Фактически бил „конструиран“ и получен нов микроорганизъм. Няма съмнение, че тази изящно изпълнена генноинженерна работа ще влезе в учебниците, тъй като тя по неоспорим начин демонстрира извънредно богатите възможности на съвременната биохимия и молекулярна генетика и на генноинженерните методи.

През 1982 година научните списания донесоха вестта за един голяма заслужен успех на българската наука: научен колектив от Института по молекулярна биология при БАН, ръководен от професор Асен Асенов Хаджиолов, успя да дешифрира в сътрудничество със специалисти от Института по молекулярна биология при АН на СССР нуклеотидната последователност в големия рибозомен ген 25S на дрождите от вида Захаромицес церевизие. От българска страна в колектива участвуваха О. И. Георгиев и Н. Николаев, а от съветска — Г. К. Скрябин, В. М. Захариев и А. А. Баев. За да разгадаят първичната структура на гена, който съдържа 3392 нуклеотидни остатъка, научният колектив си послужи с метода на Джилберт, който е Нобелов лауреат и един от основоположниците на изследвания в областта на химията на нуклеиновите киселини.

Работата по разгадаването структурата на големия рибозомен ген беше завършена за около 1 година, но тя е плод на дългогодишния опит, натрупан у нашите учени в резултат на изследвания върху рибозомите. Вече близо 20 години оглавяваната от проф. Асен А. Хаджиолов научна група изучава структурата, функциите и механизмите на действие на рибозомите — тези наистина уникални по своята прецизна дейност клетъчни „фабрики“ за белтък. С право може да се каже, че ръководената от проф. Хаджиолов научна група има вече световна известност и солиден приоритет в изследванията, свързани със структурата, функциите и биогенезата на рибозомите в еукариотни клетки, както и върху свързаните с тях процеси на генна експресия (изява), извършваща се в процесите на белтъчната биосинтеза.

Вниманието на нашите учени върху рибозомите на едноклетъчните дрождени организми, с чиято помощ правят хляба и бирата, не беше насочено случайно. Тези микроорганизми са отличен модел за теоретични изследвания, тъй като изводите, направени от тяхната дейност, са валидни за много други организми, включително и най-висшите. Колективът на проф. А. А. Хаджиолов вече беше установил един извънредно важен факт — че от рибозомната РНК в дрождите може да бъде изолирано точното първично копие на гена, който се намира в молекулата на ДНК. С тази си работа българските биолози обърнаха внимание на отлично работещата група на акад. А. А. Баев, която вече се била насочила към дешифриране първичната структура на ДНК. Освен това съветската група притежавала и клонирани парчета от рибозомната ДНК на дрожди, но точното разположение на гена в ДНК-молекулата било неизвестно.

Нашите специалисти предложиха едно елегантно и остроумно решаване на задачата. Те решиха да направят „картиране“, като върху парчето ДНК бъде наложена рибозомната РНК. Тъй като последната е точно копие на гена, то тя може да се намести само на едно единствено място в нишката на ДНК. Веднъж осъществено, това наместване показва къде точно започва и къде свършва генът във веригата на ДНК. През 1980–1981 година обединеният колектив успешно определи началния и крайния жалон, бележещи границите на рибозомния ген, и пристъпи към безспорно най-важната и най-съществена част от изследванията си — пълното дешифриране на съдържащия 3392 нуклеотидни остатъка ген.

Работата беше доведена до своя успешен край, благодарение на което сега се знае, че големият рибозомен ген на дрождите от вида Захаромицес церевизие е съставен от почти четири хиляди звена. Тяхната последователност беше описана в съвместна публикация на българо-съветския колектив и публикувана в авторитетното списание „Нуклеик есидс рисърч“ през 1981 година. А тъй като рибозомната РНК е точно копие на този ген, то автоматично стана известна и нейната структура.

Специалистите по молекулярна биология оцениха по достойнство работата на нашите и съветските учени. Защото за пръв път беше дешифриран генетичен материал от рибозома и най-вече заради участието на наши учени, което издига твърде високо авторитета на българската молекулярна генетика.

Вярваме, че няма да са малко хората, които ще запитат, и то с пълно право, с какво въпросната съвместна работа ще допринесе за развитието на науката или практиката?

На първо място отново изтъкваме, че за първи път в света бе установена първичната структура на рибозомен ген от еукариотна клетка, което ще позволи в бъдеще да се разкрие точната структура на други рибозомни гени. Резултатите от подобни изследвания имат двояко значение. Чрез тях може да се проследи как е вървяла еволюцията в света на еукариотите, тъй като ще бъде установено каква е разликата в първичната структура на рибозомните им гени. Освен това установяването на точната нуклеотидна последователност в рибозомните гени означава докосване до въпроси, отнасящи се до предбиологичната и биологичната еволюция.

От друга страна, известно е, че в бактериите от вида Е. коли 7-те рибозомни гена функционират значително по-активно, отколкото останалите близо 3000, взети заедно. Тази активност на рибозомните гени се дължи на намиращия се непосредствено преди гена промотор, който работи изключително силно. Преведено на биохимичен език, това означава, че той има свойството да се свързва извънредно здраво с ензимите, осъществяващи преноса на информация (транскрипцията) от ядрото към цитоплазмата. Разработката на нашите учени породи идеята да бъде отрязан силният промотор от рибозомния ген и да се прикрепи към друг ген, отговорен за синтезата на ценен белтък, растежен хормон или друго важно за стопанството биологичноактивно вещество. За съвременните специалисти по генно инженерство една такава манипулация няма да представлява особена трудност. Ако промоторът е с дешифрирана нуклеотидна последователност, то той би могъл да бъде синтезиран и по изкуствен начин.

На второ място стои не по-маловажният въпрос за практическото използване на научната разработка на нашите специалисти. Известно е, че дрождите са един ценен производител на белтък, който се използва за храна на селскостопанските животни. Сега, когато познаваме детайлно структурата на отговорен за биосинтезата на белтъка рибозомен ген, закономерно възниква въпросът: нима не е възможно по принцип да бъде увеличен броят на рибозомите в клетката и по този начин да получим по-големи количества хранителни белтъци за единица време?

Една друга, също не по-малко значима перспектива се отнася до възможността дрождите да заменят успешно бактериите от вида Е. коли в генноинженерната практика. За да накарат мъничките труженици да произвеждат евтино и в неограничени количества необходимите за човешката практика ензими, хормони, витамини и други подобни вещества, изследователите внедряват в генома им гени от еукариотни организми. А микроорганизмите Е. коли са все пак прокариоти — оттук произлизат и главните затруднения и противоречия в някои генноинженерни разработки. А както ще видим по-нататък в нашата книга, селското стопанство, химическата, нефтодобивната, хранителната и други промишлености вече поставят задачи за бактериални производства, от реализирането на които се очаква милиарден стойностен израз. Дрождите, които са просто устроени еукариотни клетки, стоят много по-близо по структура и функции до сложните растителни и животински клетки. По тази причина те сега стоят на първо място сред кандидатите, идващи да сменят коли-бактериите в бъдещите генноинженерни проекти.

В заключение можем да кажем, че българските специалисти в областта на молекулярната биология направиха в сътрудничество със съветските си колеги голяма крачка към разгадаване тайните на живата материя, за което заслужават поздравления и пожелания за още по-големи успехи.