Джеймс Д. Уотсън, Андрю Бери
ДНК: Тайната на живота (11)

Осма глава
Разчитане на геномите: Еволюция в действие

Желанието ми беше, когато секвенционирането на човешкия геном бъде най-после завършено, да се окаже, че съдържа 72 415 гени. Тази озадачаваща цифра се роди в съзнанието ми в резултат на първата голяма изненада на Проекта за изучаване на човешкия геном. През декември 1999 година, притиснат между две големи забележителности при секвенционирането — първия и втория милиард, бе завършена напълно първата хромозома — хромозома 22. Макар и малка по размери, обхващаща едва 1,1% от целия геном, хромозома 22 бе дълга 33 400 000 базови двойки. Така за първи път добихме представа как би изглеждал целият геном; както писа един коментатор за „Нейчър“, това бе като да „видиш за първи път повърхността или пейзаж на нова планета“. Особено интересна бе плътността на гените по хромозомата. Нямаше причина да смятаме, че хромозома 22 не е показателна за целия геном, затова очаквахме в нейната последователност да открием около 1,1% от всички човешки гени. Следователно, тъй като според предположенията човешките гени бяха общо около 100 000, в хромозома 22 трябваше да открием около 1 100 от тях. Бе открита обаче почти половината от тази цифра: 545. Това бе първият основателен факт, който ни накара да се замислим, че човешкият геном може би все пак не е така богат на гени, както предполагахме.

Внезапно броят на човешките гени събуди всеобщия интерес. По време на конференцията по въпросите на генома, проведена през май 2000 година при лабораторията към Колд Спринг Харбър, Юан Бърней, ръководещ компютърния анализ на последователността в центъра „Санджър“, организира състезание, което нарече „Помитане на гена“. Това бе нещо като лотария за отгатване на верния брой на гените, който щеше най-после да бъде определен при завършването на последователността през 2003 година; победител щеше да бъде далият най-близък до правилния отговор. (Никой не се изненада, че Бърней бе станал нещо като неофициален събирач на облози на участниците в Проекта за изучаване на човешкия геном: цифрите бяха неговата стихия. След „Итън“, той посвети една година на количествени проблеми в биологията, докато живя в къщата ми на Лонг Айлънд — нищо общо с обикалянето из Хималаите или работата в бар в Рио, само два от най-вероятните начини, по които младите англичани прекарваха междинната година преди университета. И в резултат на работата му се родиха две много важни тези, преди дори да е стъпил в Оксфорд.)

Първоначално Бърней вземаше по 1 $ за вписване, но цената за допускането нарастваше с всяко следващо публикуване на предполагаемо число, което ни приближаваше до окончателния брой. Аз успях да вляза още в началото, като заложих 1 $ за 72 415. Залогът ми беше опит да примиря числото от учебниците, 100 000, с новото най-вероятно според повечето предположение — 50 000, базиращо се върху резултатите, получени от хромозома 22. Сега, когато пиша тези редове, точният брой все още е неизвестен, но с всеки следващ месец предположението ми изглежда все по-далече от вероятността. Както изглежда ще изгубя 1 $ покрай генома.

Може би единственият друг въпрос, породил толкова празни предположения както въпросът за броя на гените, бе чии гени секвенционирахме. Информацията беше по принцип поверителна, така че нямаше как да се залага, но въпреки всичко мнозина си задаваха този въпрос. В случая с обществения проект, секвенционираните от нас образци ДНК бяха взети от неколцина, случайно избрани човека около Бъфало, щата Ню Йорк, регионът, където се извършваше работата по изолирането на ДНК и вкарването й в изкуствени бактериални хромозоми за картиране и секвенциониране. Първоначално „Селера“ твърдеше, че нейният материал също е взет от шестима анонимни донори, представители на различни култури, но през 2002 година Крейг Вентър не устоя на изкушението да заяви пред света, че главният секвенциониран геном е всъщност неговият собствен. Днес тази последователност е последната останала връзка на Вентър с компанията. Притеснена, че секвенционирането на геноми, макар и славно и достойно за новините, не е кой знае каква бизнес перспектива, „Селера“ се преустрои във фармацевтична компания и през 2002 година каза „сбогом“ на своя създател. Вентър пък основа два нови института, един за изследване на етичните въпроси, породени от съвременната генетика, и втори за използване геномите на бактериите за откриване на източници на самовъзстановяваща се енергия.

 

 

Сега, след като разполагаме с цялата груба чернова, се потвърди, че в плътността на гените на хромозома 22 няма нищо нетипично. Със своите 545 гени, хромозома 22 е по-скоро богата, отколкото бедна на гени за дължината си. На хромозома 21, която е горе-долу със същите размери, бяха локализирани само 236 гени. Досега бяха намерени само 35 000 гени върху двайсет и четирите напълно завършени човешки хромозоми. И макар да е ясно, че броят им може само да нарасне със следващите открития, вече сме убедени, че окончателният брой ще се окаже по-малък дори от 50 000, да не говорим за 100 000.

А точно колко под 50 000, на това ще отговори единствено времето. Откриването на гени не е чак толкова директна задача: кодиращите белтъци участъци са просто поредици от А-та, Т-та, Г-та и Ц-та, намиращи се сред всички останали А-та, Т-та, Г-та и Ц-та на генома — те не се отделят едни от други по някакъв явен начин. И да не забравяме — само около 2% от човешкия геном всъщност кодират протеини; останалите проценти, наречени не особено ласкателно „калпави“, са изградени от очевидно лишени от функция вериги с различна дължина, като много се срещат многократно. Нещо повече, те могат да се срещнат дори в самите гени; осеяни с некодиращи сегменти (интрони), гените понякога заемат огромни дължини от ДНК, като кодиращите части наподобяват градчета, изолирани между голи откъслеци молекулярна магистрала. Най-дългият, открит засега човешки ген, дистрофин (чиято мутация причинява мускулна дистрофия), се разпростира в продължение на 2 400 000 базови двойки. От тях едва 11 055 (0,5% от гена) кодират протеина; останалото се състои от седемдесет и деветте интрона на гена (типичният човешки ген има осем). Именно тази странна архитектура на генома затруднява толкова идентифицирането на гените.

Но уточняването на човешкия геном се улесни сега, след като геномът на мишката бе опознат по-добре. Заслуга за това има еволюцията: във функционалните си части геномите на човека и на мишката, както и на всички бозайници, са забележително подобни; наблюдават се незначителни отклонения за необозримия отрязък от време, който ни дели от общия предшественик на двата вида. Положението обаче е съвсем различно при калпавите ДНК участъци; тъй като естественият подбор не държи в строги рамки мутацията, както става с кодиращите сегменти, тя достига такива размери, че води до значителна генетична дивергенция между двата вида в тези участъци. Затова търсенето на подобия в последователностите на човешкия и мишия геном е ефикасен начин за идентифицирането на функционалните участъци или гените.

Идентифицирането на човешките гени се улеснява също така от завършването на работния вариант на генома на рибата-балон. Фугуто, както е по-известна за любителите на японската кухня, съдържа мощен невротоксин; компетентният готвач отделя съдържащите отровата органи, така че вечерята би трябвало да причини само леко изтръпване на устата. Всяка година обаче, около осемдесет човека умират от лошо приготвено фугу, а на императорското семейство на Япония е забранено със закон да се наслаждава на този деликатес. Преди повече от десет години Сидни Бренър разви слабост към рибата-балон, поне като обект за генетично изследване. Нейният геном, само една девета от нашия като големина, съдържа много по-малко некодиращ материал от човешкия: приблизително една трета от него кодира протеини. Под ръководството на Бренър първоначалният вариант на генома на фугуто бе завършен за около 12 000 000 $, наистина добра сделка по стандартите за секвенциониране на геноми. Броят на гените сега изглежда ще се окаже някъде между 32 000 и 40 000, доста близък до човешкия. Интересно е обаче, че, макар гените на фугуто да имат приблизително същия брой интрони като човешките и мишите гени, при фугуто интроните са значително по-къси.

Дори цифрата 35 000, предполагаемият брой в момента на човешките гени, създава донякъде преувеличено впечатление за генетичната ни сложност. През еволюцията някои гени са създали други, свързани по някакъв начин с тях, и така се стига до появата на групи от гени с уж подобни, но фини разлики във функциите. Тъй наречените „генни семейства“ се пораждат случайно, когато, при производството на яйцеклетката или сперматозоидите, някаква част в хромозомата се дублира непреднамерено и хромозомата се оказва с две копия на даден ген. Стига едното копие да продължава да функционира, естественият подбор оставя без внимание другото свободно да се отклонява в каквато посока избере евентуално еволюцията, докато мутациите се натрупват. Понякога мутациите водят до придобиването на нова функция от гена, обикновено тясно свързана с функцията на първоначалния ген. Много от нашите гени всъщност са леки вариации върху относително малко генетични теми. Така например, 575 от нашите гени (почти 2% от общия брой) отговарят за кодирането на различни форми протеинкиназни ензими — химически посланици, пренасящи сигнали из клетката. Деветстотин гена стоят в основата на способността на човешкия нос да усеща мирис: кодираните протеини са рецептори за мирис и всеки разпознава различен мирис на молекула или клас молекули. Същите тези 900 гена на обонянието присъстват и в мишката. Но разликата е следната: тъй като се е адаптирала предимно към нощен живот, мишката се нуждае много повече от своето обоняние и естественият подбор поддържа в активно състояние повечето от тези 900 гена за различаване на миризми. При човека обаче, около 60% от тях се притъпяват в процеса на еволюция. Тъй като сме ставали все по-зависими от зрението, ние сме се нуждаели от все по-малко рецептори на обонянието и естественият подбор не се е намесвал, когато, в резултат на мутации, много от въпросните гени губят способността си да произвеждат функциониращи белтъци и в резултат имаме доста слабо обоняние в сравнение с другите топлокръвни създания.

Нека да сравним броя на нашите гени с броя им при някои други организми:

Популярно название	Научно название	Брой гени
Човек	Homo sapiens	35 000
Синап	Arabidopsis thaliana	27 000
Нематоден червей	Caenorhabditis elegans	20 000
Плодова мушица	Drosophila melanogaster	14 000
Хлебна мая	Saccharomyces cerevisiae	6 000
Чревна бактерия	Escherichia coli	4 000

Следователно, когато става дума за гени, не сме кой знае колко по-сложни от едно растение. Още по-отрезвяващо е сравнението с нематодния червей — състоящо се само от 959 клетки създание (докато нашите са около сто трилиона), от които 302 са нервни клетки, образуващи определено простия мозък на червея (нашият главен мозък се състои от 100 000 000 000 нервни клетки); при несравнимо по-голямата сложност в структурно отношение, нашите гени не са дори два пъти повече от неговите. Как може да се обясни това смущаващо несъответствие? Изобщо няма причина за смущение: както изглежда, просто хората са способни да свършат доста повече работа с генетичния си хардуер.

Моето предположение е, че съществува връзка между интелигентността и малкия брой на гените. Според мен да бъдеш умен, тоест да имаш приличен нервен център като нашия или дори като на плодовата мушица, позволява съществуване на високо по сложност ниво с относително малко гени (ако определението „малко“ има нещо общо с числото 35 000). Нашият главен мозък ни дава сензорни и нервномоторни способности далеч над тези на дългия 2–3 см нематоден червей, и следователно по-широк обхват възможности за поведенчески реакции. А вкорененото растение има още по-малко възможности: то се нуждае от пълен набор вградени генетични ресурси, за да се справи с потенциално възможните за възникване ситуации. Затова пък притежаващите мозък видове могат да реагират и ако например се застуди рязко, да потърсят по-благоприятни условия (например да влязат в някоя топла пещера).

Сложността на гръбначните също може да се увеличи чрез съвършените превключватели, които обикновено се намират край гените. Щом приключим със секвенционирането на гените, ще можем да започнем да анализираме детайлно тези, обграждащи гените участъци. Именно тук се осъществява регулацията като регулиращите протеини се свързват с ДНК, за да включат или изключат съседния ген. Гените на гръбначните животни, както изглежда, се управляват от значително по-усложнен комплект механизми, отколкото по-простите организми. Тази по-пъргава и съвършена координация на гените прави възможно усложняването на гръбначните. Нещо повече, един-единствен ген е в състояние да произвежда много различни белтъци или защото отделните белтъци се групират за създаването на малко по-различни протеини (процес, известен като „алтернативен сплайсинг“), или защото биохимичните промени на белтъците се осъществяват вече след като са произведени.

Неочаквано малкият брой човешки гени породи появата на някои размисли за неговото значение. Те бяха съсредоточени върху една и съща тема. Стивън Джей Гоулд (чиято преждевременна смърт накара да замлъкне един пламенен глас) сравни в „Ню Йорк Таймс“ малкия брой с надгробен звън за редукционизма, царуващата доктрина в буквално всички биологични изследвания. Според нея сложните системи се изграждат отдолу нагоре. Казано по друг начин: за да бъдат разбрани събитията с по-сложно ниво на организация, трябва първо да се проумеят на по-прости нива и по-простите начини на функциониране да бъдат съединени. Оттук следва, че като разберем как работи геномът, в крайна сметка ще ни се изясни и как са съставени организмите. Гоулд и други приемат изненадващо малкия брой човешки гени като доказателство, че въпросният подход отдолу нагоре е невалиден. Неочакваната генетична простота, твърдяха антиредукционистите, беше убедително доказателство, че не можем да разберем себе си като сума от по-дребни процеси. За тях малкият брой на гените говореше, че възпитанието, а не природата, е главният определящ фактор в какво ще се превърне всеки от нас. Накратко, това бе заявление за нашата независимост от предполагаемата тирания на гените.

И аз като Гоулд съм наясно, че възпитанието играе важна роля в оформянето на всеки от нас. Преценката му за мястото на природата в този процес обаче е абсолютно невярна: малкият брой на гените в никакъв случай не прави невалиден редуционисткия подход към биологичните системи, нито оправдава правенето на логическото заключение, че гените ни не са определящият фактор. Оплодената яйцеклетка с геном на шимпанзе неизбежно произвежда шимпанзе, докато оплодената яйцеклетка, съдържаща човешки геном, създава човешко същество. Никакво слушане на класическа музика или гледане на насилие по телевизията не е в състояние да промени това. Да, предстои ни да изминем още много дълъг път, докато разберем точно как информацията от тези два забележително подобни генома успява да произведе два очевидно съвсем различни организма, но остава фактът, че основната определяща роля за това какъв ще бъде всеки отделен организъм е програмирана вътре във всяка клетка, в генома. За мен малкият брой човешки гени е добра новина за стандартните редукционистки подходи в биологията: много по-лесно е да се оправиш с 35 000, отколкото със 100 000 гени.

 

 

И макар да нямаме особено голям брой гени, ние, хората, както илюстрира генът дистрофин, имаме голям, объркан геном. Да се върнем отново към сравнението с червея: гените ни не са дори два пъти повече от неговите, но геномът ни е трийсет и три пъти по-голям. Откъде идва несъответствието? Генните картографи сравняват човешкия геном с пустиня, по която тук-там се забелязват генни оазиси — гените. Петдесет процента от генома представляват повтарящи се, привидно калпави последователности без ясна функция; цели 10% от нашата ДНК се състоят от 1 000 000 000 пръснати копия от една последователност, наречена „Alu“:

ГГЦЦГГГЦГЦГГТГГЦТЦАЦГЦЦТГТААТЦЦЦАГЦАЦТТТГГГАГГЦЦГАГГЦГГГЦГГАТЦАЦЦТГАГГТЦАГГАГТТЦГАГАЦЦАГЦЦТГГЦЦААЦАТГГТГАААЦЦЦЦГТЦТЦТАЦТАААААТАЦТАЦТЦГГГАГГЦТГАГГЦАГГАГААТЦГЦТТГААЦЦЦГГГАГГЦГГАГГТТГЦАГТГАГЦЦГАГАТЦГЦГЦЦАЦТГЦАЦТЦЦАГЦЦТГГГЦГАЦАГАГЦГАГАЦТЦЦГТЦТЦАААААА

Напишете я един милион пъти и ще добиете представа до каква степен „Alu“ е представена в нашата ДНК. Всъщност нивото на повтарящата се последователност е дори още по-високо, отколкото изглежда: последователности, които биха били открити веднага както се открива всяко повторение, в резултат на мутациите при много поколения, са се отклонили до такава степен от първоначалния си вид, че не могат да бъдат разпознати като членове на определен клас повтаряща се ДНК. Представете си комплект от три кратки повторения: АТТГ АТТГ АТТГ. С времето мутацията ще ги промени, но ако става дума за кратък период, все още ще бъдем в състояние да разберем откъде произхождат: АЦТГ АТГГ ГТТГ. След по-дълъг период първоначалната им идентичност се губи напълно в мутационната бъркотия: АЦЦТ ЦГГТ ГТЦГ. Пропорциите на повтарящата се ДНК са значително по-малко при много други видове: повтарят се 11% от генома на синапа, 7% от генома на нематодния червей и само 3% от генома на плодовата мушица. Големите размери на нашия геном се дължат най-вече на факта, че съдържа много повече лош материал в сравнение с много други видове.

Тези разлики в количеството лоша ДНК обясняват еволюционния ребус, развиван в продължение на милиони години. Очакването е по-сложните организми да имат по-големи геноми от по-простите, защото при тях се кодира повече информация. Действително съществува връзка между размерите на генома и нивото на сложност на организма: геномът на хлебната мая е по-голям от генома на E.coli, но е по-малък от нашия. Тази връзка обаче е доста слаба.

Популярно название	Научно название	Приблизителна големина на генома (милиони базови двойки)
Плодова мушица	Drosophila melanogaster	180
Фугу (риба-балон)	Fugu rubripes	400
Змия	Boa constrictor	2 100
Човек	Homo sapiens	3 100
Скакалец	Schistocerca gregaria	9 300
Кромид лук	Allium cepa	18 000
Тритон	Amphiuma means	84 000
Lungfish_	Protopterus aethiopicus	140 000
Папрат	Ophioglossum petiolatum	160 000
Амеба	Amoeba dubia	670 000

Разумно е да се предположи, че естественият подбор поддържа размерите на генома колкото може по-малки. Все пак, при всяко делене, клетката трябва да удвои своята ДНК; колкото повече трябва да копира, толкова по-голяма е вероятността от грешки и толкова повече енергия изисква процесът. Това е наистина голямо начинание за амебата (или тритона). Каква може да е причината количеството на ДНК при тези видове да излезе така от контрол? В случаите на необичайно големи геноми можем само да предположим, че някакви други сили на естествения подбор са обезсилили импулса за поддържането на генома в определени рамки. Не е изключено например, големите геноми да са предимство за видовете, които е по-вероятно да бъдат изложени на екстремални условия в околната среда. Lungfish живее на границата между водата и сушата и е в състояние да издържи продължителни периоди на засушаване, като се заравя в калта; може би тя се нуждае от по-голям генетичен хардуер от видовете, адаптирани за живот в една среда.

Два основни еволюционни механизма обясняват този излишък от ДНК: удвояването на генома и пролиферацията на определени последователности вътре в генома. Много видове, особено в растителното царство, са всъщност продукт от кръстоската на два, съществували преди това вида. Новите видове често просто комбинират ДНК от двата родителски вида и геномът им се удвоява. Геномът обаче може да се удвои и поради някакъв генетичен инцидент, без намеса на други видове. Например, един от любимците на молекулярната биология, хлебната мая, има около 6 000 гени. Но при вглеждане се установява, че много от тях са дубликати — хлебната мая често има две дивергентни копия на много от своите гени. В някакъв ранен стадий от еволюционната си история геномът на маята явно се е удвоил. Първоначално копията на гените са били идентични, но с времето са се получили отклонения.

Дори още по-богат източник на излишък от ДНК се получава от умножаването на генетични последователности, способни да се възпроизвеждат и да проникват на повече от едно места в даден геном. Тези тъй наречени „подвижни елементи“ са открити в много варианти. Но когато Барбара Макклинтък съобщава за първи път за откриването им през 1950 година, самата идея за „скачащи“ гени изглежда прекалено невероятна за повечето учени, свикнали с простата логика на Мендел. За Макклинтък, превъзходен царевичен генетик, това не е първото препятствие в професионалната област. Когато през 1941 година става ясно, че няма да бъде назначена в Университета на Мисури, тя идва в лабораторията при Колд Спринг Харбър, където остава до смъртта си през 1992 година на деветдесетгодишна възраст. Веднъж Макклинтък каза на един колега: „Наистина вярвай на това, което виждаш.“ Точно така се занимаваше с наука тя: революционната й идея, че някои генетични елементи могат да се движат из геномите следваше от вече наблюдавани факти. Тя бе изучавала генетиката в основата на различно оцветените царевични зърна и бе забелязала, че понякога, насред своето развитие, дадено зърно променя цвета си. И тогава зърното може да стане пъстро, с участъци, където клетките са в очаквания жълт цвят и други участъци, където са пурпурни. Как да бъде обяснена тази внезапна промяна? Макклинтък изказва идеята, че даден генетичен елемент, подвижен елемент, скача вътре във или изскача от отговарящия за пигментацията ген.

Едва с появата на технологиите за рекомбинантната ДНК можахме да установим колко са разпространени подвижните елементи; сега се смята, че са важен компонент от много, ако не и от повечето геноми, в това число и от нашия. А някои от най-разпространените подвижни елементи, тези, които се появяват отново и отново на различни места в един и същ геном, са получили имена, отговарящи на „номадския“ им начин на живот: два мобилни елемента на плодовата мушица например, са наречени „циганин“ и „скитник“. А онези, които изучават семплото растение с наименование Volvox знаят, че заради невероятното си умение да скача из генома, един от подвижните му елементи е известен като „Майкъл (Джордан)“.

Подвижните елементи съдържат ДНК, кодираща ензими, които, чрез умението си да режат и лепят хромозомна ДНК, правят възможно копията от техния елемент да бъдат вкарвани на нови места в хромозомата. Ако скокът отведе подвижния елемент в лоша последователност, това не се отразява върху функционирането на организма; единственият резултат е увеличаването на лошата ДНК. Но когато при скока подвижният елемент се приземи в жизненоважен ген и вследствие на това го извади от строя, естественият подбор се намесва: организмът или умира, или му се попречва по някакъв друг начин да предаде новия ген. Много рядко движението на подвижните елементи създава нови гени или променя старите по благотворен за организма начин. И така, в процеса на еволюцията ефектът от мобилните елементи изглежда е предимно пораждането на нещо ново. Любопитно, но в най-новата човешка история се наблюдават малко доказателства за активно скачане: както изглежда, повечето ни лоша ДНК е генерирана много отдавна. Затова пък геномът на мишката съдържа много активно влизащи в него подвижни елементи, което го прави доста динамичен. Този факт обаче, явно не притеснява ненужно въпросния вид; присъщият за мишките висок потенциал за възпроизвеждане помага на вида като цяло да понесе генетичните катастрофи, породени от честото скачане в жизненоважни, функциониращи генетични участъци.

 

 

Наблюденията върху E.coli като модел организъм са безценни за установяването на много основни факти за функционирането на ДНК. Затова не е учудващо, че геномът на въпросната бактерия заема едно от първите места в списъка с геномите, които трябва да се секвенционират първо в подготвителната фаза на Проекта за изучаване на човешкия геном. Фред Блатнър от Уисконсинския университет изгаряше от ентусиазъм да се залови със секвенционирането на E.coli. Но така и не получи средства за тази цел и едва когато Проектът за изучаване на човешкия геном бе финансиран, той се добра до една от първите значителни субсидии за секвенциониране. Ако не беше първоначалната му неохота да използва автоматизираното секвенциониране, неговата лаборатория щеше да секвенционира първа пълен бактериален геном. Но през 1991 година неговата стратегия за осъществяване на операцията беше съвсем старомодна: да се използват повече студенти. Друг от късно приелите автоматизирането беше Уоли Гилбърт, когото две години по-рано бях убедил да се заеме с един от най-малките известни ни бактериални геноми, по-точно на паразита Mycoplasma — миниатюрна бактерия, която живее в клетките. Тъжно, но свързаният му с Mycoplasma проект умря заедно с осуетяването на умната му нова стратегия за секвенциониране. Блатнър обаче, възприе автоматизирането все пак навреме и през 1997 година установи, че геномът на E.coli съдържа около 4 100 гени.

Но по-мащабното надбягване за създаването на първия цял бактериален геном, бе спечелено две години преди това в Института за изследване на генома (ИИГ) от голям екип, ръководен от Хамилтън Смит, Крейг Вентър и неговата съпруга Клер Фрейзър. Секвенционираната от тях бактерия е Haemophilus influenzae, от която двайсет години по-рано Смит, високият метър и деветдесет и пет сантиметра някогашен дипломант по математика, избрал впоследствие медицината, бе изолирал първите полезни рестрикционни ензими на ДНК, подвиг, който му донесе Нобеловата награда за физиология или медицина за 1978 година. С приготвената от Смит ДНК на Haemophilus, Вентър и Фрейзър използват подхода „цяла геномна пушка“ за нейните 1 800 000 базови двойки. Документирането на първия „малък“ геном показваше достатъчно ясно какви трябва да бъдат размерите на по-големите, които тепърва трябваше да се секвенционират: ако всички А-та, Г-та, Ц-та и Г-та на генома на Haemophilus се отпечатат върху хартия с размерите на тази книга, ще се получи том с около 4 000 страници. Средно по две страници ще бъдат необходими за всеки един от 1 727-те гена. Бяха идентифицирани функциите само на 55% от тях: например в производството на енергия участват поне 112 гена, а за репликацията, възстановяването и рекомбинацията на ДНК са нужни минимум 87. От последователностите може да се отсъди, че останалите 45% също са функциониращи гени, но на този етап не можем да бъдем сигурни какво точно правят.

По бактериалните стандарти геномът на Haemophilus е доста малък. Размерите на бактериалния геном са свързани с разнообразието на околната среда, в която може да се срещне даден вид. Вид, който води еднообразно съществуване в еднородна среда, например в корема на друго същество, може да мине с относително малък геном. Но ако се надява да види по-голяма част от света и съответно — да попадне в по-разнообразни условия, трябва да бъде екипиран, за да реагира адекватно, и гъвкавостта на реакциите обикновено зависи от наличието на алтернативни комплекти от гени, всеки създаден за специфични условия и готов във всеки момент да бъде включен или изключен.

Бактерията Pseudomonas aeruginosa, която може да предизвика инфекции при хората (и представлява особена опасност за болните от кистозна фиброза), обитава при съвсем различни условия. В Пета глава видяхме как генетично модифициран сроден вид стана първия патентован жив организъм; в този случай той бе адаптиран за живот в петролни петна, забележимо различаваща се от човешките бели дробове среда. Геномът на Pseudomonas aeruginosa съдържа 6 400 000 базови двойки и 5 570 гена. Около 7% от тези гени кодират фактори на транскрипцията, белтъци, които включват и изключват гените; следователно значителна част от генетичното й съдържание е посветено на регулацията. Репресорът на E.coli, чието съществуване беше предсказано от Жак Моно и Франсоа Джейкъб в началото на шейсетте години на XX век (вижте Трета глава), е точно такъв фактор на транскрипцията. Така се налага следното правило: в колкото по-разнообразна среда е възможно да се срещне даден вид бактерия, толкова по-голям е нейният геном и толкова по-голяма част от генома е посветена на превключването на гени.

Институтът за изследване на генома не се ограничава с Haemophilus. През 1995 година, в сътрудничество с Клайд Хътчисън от Университета на Северна Каролина, институтът секвенционира генома на Mycoplasma genitalium като част от тъй наречения „минимален проект за изучаване на генома“. M.genitalium (който, въпреки злокобното си име, е доброкачествен обитател на човешкия „водопровод“) има най-малкия известен невирусен геном, от около 580 000 базови двойки. (Вирусите имат по-малки геноми, но като стават членове на геномите на своите приемници, могат да минат без собствени средства за осъществяването на много фундаментални процеси.) Беше открито, че тази относително къса последователност се състои от 517 гена. Така възникна един естествен въпрос: това ли е минималното количество гени, необходимо за поддържане на живота? По-нататъшните изследвания се съсредоточиха върху изваждането от строя на гени на M.genitalium, за да се разбере кои са абсолютно необходими за живота на бактерията и кои — не. Събраните до този момент данни показват, че минималният геном съдържа не повече от 350, ако не и 260 гени. Наистина този „минимум“ е определен по донякъде изкуствен начин, защото на отслабените организми се осигуряват всички нужни за съществуването им вещества. Нещо подобно би било да се твърди, че бъбреците не са нужни, защото пациентите оцеляват и благодарение на апаратите за хемодиализа.

Ще успеем ли някога да създадем функционираща минималистична клетка от нулата, чрез изкуствено комбиниране на отделните й пречистени компоненти? Като се има предвид, че засега функциите на повече от сто белтъка на Mycoplasma genitalium остават мистерия, постигането на тези цел изглежда се губи далече напред в бъдещето. Дори петстотинте протеина на Mycoplasma, някои представени в клетката от огромен брой молекули, други — само от няколко, образуват изключително сложна жива система. На мен, например, ми е много трудно да гледам филм с повече от четири-пет главни герои; невъобразимо е да си помисля, че е възможно да бъдат проследени сложните взаимоотношения между жизненоважните участници в една жива клетка. Тъй като живата клетка не е подредена миниатюрна машинка, а по-скоро, по израза на Сидни Бренър, „змийско гнездо с гърчещи се молекули“. Въпреки това Крейг Вентър е уверен, че ерата на изкуствената клетка ще настъпи всеки момент и, без да губи време, събра екип от специалисти в областта на биологичната етика, за да се консултира с тях дали да продължава нататък. И те като мен не виждат морална дилема в опитите „да се създаде живот“ по този начин. Ако бъде постигнато някога, то просто ще потвърди това, което повечето от молекулярните биолози знаят отдавна: същността на живота е сложна химия и нищо повече. Подобно откритие би направило сензация преди един век; днес вече не е кой знае какво. Само противоположното заключение — че животът на клетката е нещо повече от сбор от основните й компоненти и процеси, би могло да предизвика дълбоко вълнение в съвременния научен свят.

 

 

Анализът на ДНК вече промени лицето на микробиологията. Преди ДНК техниките да започнат да се използват широко, методите за идентифициране на бактериалните видове бяха изключително ограничени във възможностите си за разлагане на съставните части: човек можеше да отбележи формата на растящите в стъклениците бактериални колонии, да види формата на отделните клетки през микроскопа или да използва относително несъвършени методи за количествен биохимичен анализ като теста на Грам, с които видовете могат да бъдат разделени на „отрицателни“ или „положителни“ в зависимост от характеристиките на клетъчната им стена. Със секвенционирането на ДНК, микробиолозите внезапно се сдобиха с идентифициращ фактор, който беше видимо, определено различен при всеки вид. Дори видове като например обитаващите океанските дълбини, които не могат да се култивират при лабораторни условия, защото е много трудно да се имитират естествените им условия за живот, са податливи на анализа на ДНК, стига от дълбините да може да се вземе мостра.

Институтът за изследване на генома, сега ръководен от Клер Фрейзър, остава лидер сред посветилите се на изучаването на бактериалните геноми. За кратко време той изяснява геномите на повече от двайсет различни бактерии, включително причиняващата язва Helicobacter, причиняващата холера Vibrio, причиняващата менингит Neisseria и причиняващата респираторни болести Chlamydia. Най-големият им конкурент е една група към центъра „Санджър“. Британският контингент се ръководи от Барт Беръл, имал късмета да не е в Съединените щати, където ограниченият му брой академични референции щеше да му попречи да заеме този висок пост: той не беше доктор на науките, беше навлязъл в науката направо от гимназията, за да работи като асистент на Фред Санджър много преди секвенционирането на ДНК да се превърне в реалност. Преди да премине към бактериите, Беръл си създаде име като пионер в автоматизирането. Той използва няколко секвенциониращи машини на корпорация „Приложни биосистеми“, за да произведе около 40% от генома на хлебната мая от 14 000 000 бази, докато предимно европейският консорциум, занимаващ се със секвенционирането на маята, остана верен на ръчните методи. По-късно групата на Беръл получи удовлетворението, че първа е завършила последователността на Mycobacterium tuberculosis, агентът на страшната болест, известна някога като „охтика“.

В гимназията Клер Фрейзър „се чувства отхвърлена, защото не е «гот» една жена да взема толкова много часове по естествени науки“. След като учи в Политехническия институт „Ренсийлър“, където в нея за първи път се пробужда интерес към микробите, тя кандидатства медицина. Вместо да приеме мястото в престижния Йейл, тя предпочита университета в Бъфало, тъй като приятелят й се премества в Торонто. Директорът по приема на студенти в Йейл е смутен: „Е, млада госпожице, надявам се, че знаете какво правите“. Връзката с Торонто обаче се оказва ефимерна; през 1981 година Фрейзър се омъжва за Вентър, по това време млад доцент в същия университет. „За медения си месец отидохме на научна конференция — спомня си тя, — и там написахме предложение за получаване на стипендия.“

Силата на ДНК анализа на микробите се използва с голям успех в медицинското диагностициране: за да се излекува успешно една инфекция, лекарите трябва първо да идентифицират причиняващия я микроб. При традиционния начин на идентифициране от инфектираната тъкан се взема бактериална култура — влудяващо бавен процес, особено когато времето е от голямо значение. Използването на бърз, лесен и по-точен ДНК тест за разпознаване на микроба дава възможност на лекарите да започнат лечението значително по-бързо. И съвсем скоро тази технология бе използвана при спешен случай в национален мащаб: търсенето на виновника за свързаното с антракс безчинство в Съединените щати през есента на 2001 година. След като секвенционираха генома на бактерията от първата жертва на антракса, изследователите от Института за изследване на генома се сдобиха с генетичен отпечатък точно на използвания щам. Надеждата е, че тази конкретна информация за източника на антракса в крайна сметка ще доведе до виновника.

Колкото повече научаваме за микробните геноми, се наблюдава следната поразителна схема. Както видяхме, еволюцията на гръбначните животни е история за прогресивната генетична пестеливост: чрез все по-широк набор от механизми за генна регулация става възможно да се прави все повече и повече със същите гени. И дори когато се появят нови гени, те обикновено са просто варианти на вече съществуваща генетична тема. Затова пък бактериалната еволюция се оказва сага за далеч по-радикална трансформация, главозамайващ процес, благоприятстващ внасянето или генерирането на напълно нови гени, вместо да промени лекичко вече съществуващите.

Всъщност рекомбинантната технология дължи съществуването си на изключителната способност на бактериите да инкорпорират нови части ДНК (обикновено плазмиди). Затова не е изненадващо, че микробната еволюция също носи отпечатъка от драматични събития с внасяне на гени от миналото. От E.coli, обикновено добронамерен обитател на нашите черва (и на лабораторните стъкленици), чрез внасянето на гени се получи вариант убиец. Токсините, произвеждани от един щам, който от време на време предизвиква хранителни отравяния (уби двайсет и един човека в Шотландия през 1996–1997 година), и големи заглавия за „бургери убийци“, са доказателство за масивно генетично „вземане назаем“ от други видове.

Генетичният материал обикновено се движи вертикално надолу по родословното дърво — от родител на потомци, докато това внасяне на ДНК отвън е известно като „хоризонтално прехвърляне“. Сравняването на последователността на генома на нормалната E.coli с някой от патогенните щамове разкрива общ генетичен „гръбнак“, идентифициращ и двата вида като представители на един вид, но се наблюдават също така множество „островчета“ с отклонения в ДНК, уникални за патогена. При патогенния щам липсват 528 гени от нормалния, но затова пък има 1 387 гени, които не присъстват в нормалния. Именно в замяната на 528 срещу 1 387 гени лежи ключът към трансформацията на един от най-безвредните продукти на природата в убиец.

И при други бактерии се наблюдава подобно доказателство за хоризонтален трансфер. Vibrio cholerae е необичайна сред останалите бактерии, защото има две отделни хромозоми. По-голямата, (дълга около 3 000 000 базови двойки) както изглежда, е първоначалната екипировка на микроба и съдържа повечето жизненоважни за функционирането на клетката гени. По-малката (дълга около 1 000 000 базови двойки) прилича на мозайка, съставена от внесени от други видове части от ДНК.

Вътрешната биохимия на сложните организми, особено на големите като човека, по замисъл се запазва доста добре: в повечето случаи, ако не изядем или не вдишаме определено вещество, то не може да ни промени значително. И така биохимичните процеси на всички гръбначни с времето обикновено остават доста подобни. Бактериите, от друга страна, са изложени в много по-голяма степен на химическите приумици на средата; напълно е възможно дадена колония да се окаже внезапно окъпана в пагубен химикал, да речем дезинфекциращо средство като белината. Затова не е чудно, че тези изключително уязвими организми създават изумително разнообразие от химически вещества. И наистина, еволюцията на бактериите зависи до голяма степен от химическите нововъведения, от измислянето на ензими (или модифицирането на вече съществуващите) за осъществяването на нови химически трикове. Един от най-невероятните и поучителни примери за този еволюционен модел се среща при бактериите, чиито тайни започнахме да опознаваме едва сега — групата, известна като „екстремофили“ поради предпочитанието на нейните членове към най-негостоприемните условия.

Бактериите са открити в горещите извори в Йелоустоун (Pyrococcus furiosus се чувства прекрасно във вряща вода и умира от измръзване при температури под 70°C) и в прегрятата вода на намиращите се дълбоко в морето дупки (където високото налягане от дълбочината не позволява на водата да ври). Открити са живеещи в силно киселинни условия като концентрирана сярна киселина, както и в силно алкална среда. Thermophila acidophilum е екстремофил, издържащ, както подсказва името й, както на високи температури, така и на ниско pH. Някои видове са открити в скали, свързани с петролни залежи, където превръщат нефта и друг органичен материал в източник на клетъчна енергия, подобно на миниатюрни сложни автомобили. Един от тези видове обитава една-две мили под скалите и умира при наличие на кислород; затова е наречен Bacillus infernus.

Може би най-забележителните микроби, открити напоследък, са тези, които разрушават някога смятания за ключов принцип на биологията, че цялата енергия за жизнените процеси идва пряко или косвено от слънцето. И докато даже Bacillus infernus и консумиращата петрол бактерия в наносните скали са свързани с органичното минало — слънцето е светило преди милиони години над животните и растенията, чиито останки днес са изкопаеми горива — тъй наречените „литоаутотрофи“ са в състояние да извличат нужните хранителни вещества от скалите, създадени отново от вулкани. В тези скали, например гранит, няма никакви остатъци от някогашен органичен живот, те не съдържат останки от енергията от слънчевите праисторически дни. Литоаутотрофите трябва да построяват свои органични молекули от неорганичен материал. Храната им се състои буквално от камъни.

Няма по-убедителен индикатор за общото ни непознаване на света на микробите от позакъснялото ни откриване на бактериалния род Prochlorococcus, чиито планктонови клетки фотосинтезират, докато се носят по повърхността на океана. Само в един милилитър морска вода може да обитават около 200 000 от тях; очевидно това е един от най-масово разпространените видове на планетата. Те определено са в основата на големия принос на океана към глобалната хранителна верига. И въпреки това до 1988 година не знаехме за Prochlorococcus.

Невероятният свят на микробите около нас отразява феноменалната мощ на извършвания в продължение на милиони години естествен подбор. Действително историята на живота на нашата планета е предимно разказ на бактериите; по-сложните организми, в това число и ние самите, са се появили смущаващо късно — нещо като появила се в последния момент идея. Както изглежда, животът се заражда във вид на бактерии преди около 3 500 000 000 години. Първите еукариоти — клетки, чиито гени са затворени в ядрото — се появяват около 800 000 000 години по-късно, но остават едноклетъчни през следващите 1 000 000 000 години. Едва преди 500 000 000 години става пробивът, който в крайна сметка води до появата на организми като земния червей, плодовата мушица и Homo sapiens. Преобладаването на бактериите е отразено в основаващата се върху ДНК реконструкция на дървото на живота, осъществена за първи път от Карл Уузи в Университета на Илинойс: дървото на живота е бактериално дърво и едва на една от израсналите му най-накрая клонки се образуват няколко многоклетъчни същества. Сега всеобщо приети, идеите на Уузи в началото срещат упорита съпротива в биологичните среди. Някои от изводите, налагащи се от основаващия се върху ДНК подход при съставянето на дървото на живота, наистина е било трудно да се приемат, например, че животните не са, както се е предполагало някога, близки роднини с растенията; най-близките роднини на животните са всъщност гъбичките. Хората и гъбите произлизат от един и същ еволюционен корен.

 

 

Проектът за изучаване на човешкия геном доказа, че Дарвин е бил по-прав, отколкото би се осмелил да се надява той самият. Молекулярните подобия произлизат в крайна сметка от начина, по който са свързани всички организми чрез общото си потекло. Успешното еволюционно „изобретение“ (мутация или поредица от мутации, предпочетени от естествения подбор) се предава по-нататък от едно поколение на следващото. С увеличаване на разнообразието на дървото на живота — съществуващите линии се разделят, за да произведат нови (влечугите си остават като такива, но от тях възникват птиците и бозайниците) — това изобретение може в крайна сметка да се появи в огромен брой потомствени видове. Около 46% от протеините, които наблюдаваме в дрождите, присъстват и в хората. Клонът на дрождите (гъбичния) и клонът, от който най-накрая се появяват хората, трябва да са се разделили преди около 1 000 000 000 години. Тъй като в резултат всеки се е развивал независимо от другия, свободен да следва собствената си еволюционна траектория, от времето на предшественика на дрождите/хората са изминали 1 000 000 000 години; и през целия този период въпросният комплект белтъци, съществувал в общия предшественик, се е променил минимално. Веднъж щом разреши даден проблем, например изобретяването на ензим за катализирането на конкретна биохимична реакция, еволюцията обикновено се придържа към това решение. Видяхме как този тип еволюционна инерция е отговорен за централната роля на РНК в клетъчните процеси: животът започва в „свят на РНК“ и наследството остава с нас до наши дни. И инерцията се простира до биохимическите детайли: 43% от белтъците на червея, 61% от белтъците на плодовата мушица и 75% от белтъците на фугу имат подчертано подобие на последователностите с човешките белтъци.

Сравняването на геномите също разкрива как еволюират протеините. На белтъчните молекули може в типичния случай да се гледа като на колекция от отделни области — вериги от аминокиселини, които имат определена функция или образуват определена триизмерна структура; както изглежда еволюцията оперира като размества областите, създавайки нови пермутации. Предполага се, че повечето пермутации са колкото случайни, толкова и безполезни, обречени да бъдат елиминирани от естествения подбор; но в редките случаи, когато новата пермутация се окаже полезна, се ражда нов протеин. Около 90% от идентифицираните в човешките белтъци области присъстват също така и в протеините на плодовата мушица и червея. Следователно, дори някой от уникалните за човека протеини най-вероятно не е нищо друго освен пренареден вариант на открит в Drosophila белтък.

Няма по-добра демонстрация за това фундаментално биохимично подобие между организмите от тъй наречените „спасителни експерименти“, чиято цел е да се елиминира даден протеин в един вид и след това да се използва съответния му протеин от друг вид, за да се „спаси“ липсващата функция. Вече видяхме как тази стратегия беше приложена в случая с инсулина. Тъй като човешкият и кравешкият инсулин са много подобни, диабетиците, които не успяват да произвеждат свой инсулин, могат да получават кравешки като заместител.

При едно изследване, достойно за научнофантастичен филм, учените успяха да предизвикат появата на очи по краката на плодовите мушици чрез манипулиране на гена, отговарящ за местоположението на очите. След това този ген подтиква многото гени, свързани със създаването на пълноценно око, да се захванат за работа на определеното място. Съответният ген при мишката е толкова подобен на гена на плодовата мушица, че ще изпълни същата функция, когато бъде разположен от генния инженер в плодова мушица, чийто ген е отстранен. Фактът, че това може да бъде осъществено, е най-малкото забележителен. Плодовите мушици и мишките са разделени от еволюцията от повече от половин милиард години, така че, следвайки приложената по-горе логика за успоредното развитие на хората и дрождите по независими клонове на дървото на живота, генът е бил запазен в продължение на повече от един милиард години еволюция. Това е още по-учудващо, като се има предвид, че строежът и зрителните свойства на очите на мишката и плодовата мушица са фундаментално различни. Очевидно всяко разклонение е създало и усъвършенствало необходимото за съответните цели око, но тъй като не се нуждае от подобряване, основният механизъм за определяне местоположението на окото си остава същият.

 

 

Най-смиряващият аспект на Проекта за изучаване на човешкия геном засега е осъзнаването колко малко знаем за функциите на повечето човешки гени. За да използваме както трябва получената с толкова усилия информация, трябва да изобретим методи за изследване функцията на гените в геномен мащаб.

В резултат на Проекта за изучаване на човешкия геном се родиха две нови научни сфери, утежнени с лишени от изображение названия, инкорпориращи „-омика“ на своя предшественик: протеомика и транскриптомика. Протеомиката изучава протеините, кодирани от гените. Транскриптомиката определя кога и къде се изявяват гените, тоест кои гени са транскрипционно активни в дадена клетка. За да бъде разбран геномът в неговата по-динамична реалност, не просто като набор от инструкции за монтирането на живота, а като сценарий за филма на живота — цялата драма, описана в точния ред, в който трябва да протече — протеомиката и транскриптомиката дават ключовете, с чиято помощ можем да надникнем към живото действие. Колкото повече научаваме, толкова повече ще видим от „Филма на живота“.

Отдавна е установено, че белтъкът е много повече в биологично отношение от линейната поредица на изграждащите го аминокиселини. Начинът, по който се разполага веригата, за да създаде отличителната триизмерна конфигурация, е наистина ключът към неговата функция — това, което се стреми да узнае протеомиката. Структурният анализ все още се прави чрез рентгенова дифракция: молекулата се бомбардира с рентгенови лъчи, които отскачат от нейните атоми и се разпръскват по схема, по която може да се определи триизмерната й форма. През 1962 година някогашните ми колеги от лабораторията „Кавендиш“ към Кеймбриджкия университет Джон Кендрю и Макс Перуц получиха Нобелова награда за химия за изясняването съответно на строежа на миоглобина (който складира кислород в мускулите) и хемоглобина (който пренася кислорода в кръвоносната система). Това бяха наистина огромни усилия. Сложността на образите, получени посредством рентгенова дифракция, които трябваше да тълкуват, ме кара да бъда благодарен за относителната простота на ДНК!

Познаването на триизмерната структура на даден белтък помага много на фармацевтите в търсенето на нови лекарства, които си вършат работата като пречат на даден протеин да функционира. Във все по-специализирания и автоматизиран свят на фармацевтичните изследвания, няколко компании предлагат да определят строежа на белтъците така, сякаш са производствена линия за една или друга стока. Работата днес е несравнимо по-лесна от времето на Перуц и Кендрю: с по-мощните източници на рентгенови лъчи, с автоматизираното записване на получаваната информация и по-бързите компютри, управлявани от все по-умен софтуер, времето за получаването на дадена структура може да бъде намалено от много години до няколко седмици.

Прекалено често обаче, триизмерният строеж сам по себе си не дава конкретни указания за функцията на този протеин. Вместо това важни ключове могат да бъдат получени от изучаването на начина, по който мистериозният белтък взаимодейства с други, вече известни белтъци. Лесен начин за установяване на такива взаимодействия е оцветяването на образци от известни протеини и поръсването им после с мистериозния протеин, предварително третиран така, че да флуоресцира под ултравиолетова светлина. Там, където нашият тестван протеин остава на определено място на протеиновата решетка върху предметното стъкло под микроскопа, значи се е свързал с друг протеин, който в резултат също ще започне да флуоресцира. Тогава евентуално тези два белтъка се модифицират така, че да си взаимодействат вътре в клетката.

За да узнаем сценария на живота, за да „видим филма на живота“, в идеалния случай трябва да открием точно всички промени в състава на протеините, които се осъществяват при индивидуалното развитие от момента на оплождането до пълното съзряване. И докато много от белтъците ще се окажат активни по време на целия процес, други ще бъдат специфични за определен период, така че при всеки етап от растежа трябва да очакваме да видим различен набор от протеини. Хемоглобинът на възрастния екземпляр и на зародиша, например, се различават леко. По същия начин всеки вариант на тъканите произвежда свой белтъчен профил.

Най-сигурният начин да се разпределят различните протеини от даден тъканен образец си остава отдавна установеният метод, при който се използват двуизмерни пихтиести утайки за отделянето на отделните протеинови молекули на базата на различията в електрическия им заряд и молекулярното тегло. Диференцираните по този начин няколко хиляди протеинови места след това могат да бъдат анализирани с масспектрометър, инструмент, с чиято помощ се определя аминокиселинната последователност на всеки от белтъците. За нещастие прилагането на протеомиката за многобройните протеини, кодирани в целия геном, изисква доста по-значително финансиране от това, с което разполагат обикновено учените. В по-голямата си част подобни скъпоструващи изследвания се оставят на по-добре осигурените изследователи към големите фармацевтични компании. Но поради ограниченията на метода, даже техните лаборатории не откриват рутинно присъстващите в извънредно малки количества белтъци.

Следователно този тип протеомика днес е неприложим за повечето учени, изследващи функциите на гена на геномно ниво, заради необходимия скъпоструващ хардуер и автоматизирани в индустриални мащаби сложни процедури. Вместо това се възприемат методите на транскриптомиката, защото са по-евтини и по-лесно приложими: функционирането на всички гени в даден геном може да се проследи чрез измерването на относителното количество на продуктите от съответната информационна РНК. Ако ви интересува активността на гените, например в човешка чернодробна клетка, изолирате проба с информационна РНК от чернодробната тъкан. Това е нещо като снимка на популацията от информационна РНК в чернодробната клетка: много активните гени, тези, които са транскрибирани най-отчетливо и които произвеждат много молекули информационна РНК, ще бъдат представени най-масово, докато рядко транскрибираните гени ще допринесат само с няколко копия за мострата информационна РНК.

Ключът към транскриптомиката е едно изненадващо просто изобретение, известно като „ДНК микроредица“. Представете си предметно стъкло за микроскоп с решетка от 35 000 миниатюрни кладенчета, издълбани в него. Чрез съответните техники във всяко кладенче с голяма точност се поставят последователности ДНК само от един ген, така че решетката да съдържа всички гени от човешкия геном. Изключително важно е да се знае местоположението на ДНК от всеки ген върху предметното стъкло. Намиращата се близо до Станфорд компания „Афиметрикс“ успя да намали още повече размерите на тези редици, като ги издълбава върху парченце силикон с големина на малък компютърен чип, получил названието „ДНК чип“.

Като използвате стандартни биохимически техники, можете да бележите чернодробната си информационна РНК с химически маркер, така че, подобно на споменатите вече протеини, да флуоресцира услужливо под ултравиолетова светлина. После идва ред на стъпката, където мощта и простотата на техниката стават очевидни: просто изсипвате мострата си от информационна РНК върху микроскопичната шахматна дъска, осеяна с 35 000, пълни с гени кладенчета. Същите връзки, които държат заедно двете вериги на двойната спирала, ще стимулират молекулата информационна РНК да се съчетае с гена, от който произлиза. Процесът на взаимно допълване е съвсем точен и сигурен: информационната РНК от ген X ще се свърже само и единствено на мястото, заемано от ген X върху микроредицата. Следващата стъпка е просто да се наблюдава кои места привличат флуоресциращата информационна РНК. Липсата на флуоресциране на дадено място е показател, че за намиращата се в него ДНК няма допълваща информационна РНК в мострата и следователно, можем да заключим, не се осъществява активна транскрипция на този ген в чернодробната клетка. От друга страна, известен брой места излъчват флуоресцентна светлина, някои особено интензивно; това е показател, че много молекули информационна РНК са се свързали с него. Заключението е, че става въпрос за извънредно активен ген. Така само с един лесен експеримент сте идентифицирали всеки един от активните в черния дроб гени. Подобни молекулярни панорами станаха възможни благодарение на успеха на Проекта за изучаване на човешкия геном и новата нагласа, която породи в средите на биолозите: вече няма защо да се задоволяваме с изследване на отделни частички, а можем да видим цялата картина в пълния й блясък.

Не е изненадващо, че Пат Браун от Станфорд, един от водещите сред практикуващите метода, гледа на ДНК микроредиците като на „нов вид микроскоп“. Възхитен от потенциала на технологията да ни разкрие цяла една генетична вселена, той заяви: „Ние едва сме проходили и тепърва започваме да откриваме нашия свят.“

Транскриптомиката е много повече от поредното бляскаво техническо нововъведение. Тя обещава да ни отведе на следващото ниво в лова на причиняващите болести гени: с помощта на технологията на микроредиците можем да открием химическата основа на конкретните заболявания, изучавайки разликите между здравата и болната тъкан като функция от изявата на гените. Логиката е проста. Правим анализ на генния израз чрез микроредиците на нормална и ракова тъкан, и отбелязваме разликите помежду им — кои гени са изразени в едната и кои — в другата. Щом веднъж идентифицираме кои гени не функционират както трябва — например се изявяват прекалено бурно или прекалено слабо в засегнатата от рака тъкан — може би ще успеем да създадем молекулярни терапии със съвсем конкретна, тясна цел, вместо изключително токсичните радио- и химиотерапия, които унищожават както болните, така и здравите клетки.

Можем да прилагаме същите технологии за установяване на тънките различия между отделните форми на едно и също заболяване. Стандартната микроскопия ни дава доста ограничена помощ в това отношение: изглеждащите еднакво за наблюдаващия през микроскоп патолог ракови тъкани може да се различават извънредно много на молекулярно ниво. Лимфомните клетки например се срещат в разновидности, които трудно могат да се отличат визуално, дори при най-висока резолюция, но разликите в профилите на начина, по който се изявяват гените им, са ясни и жизненоважни за избирането на най-ефикасното лечение. Имайки предвид доскорошната тенденция да се смята, че всички ракови клетки в дадена тъкан имат един и същ корен, Браун каза: „То е същото като да мислиш, че причината за болките в стомаха е една и съща. Разпознаването на разликите увеличава шансовете ни да лекуваме рака.“

В лабораторията при Колд Спринг Харбър Майкъл Уиглър използва метода по друг начин: вместо да добавя РНК към микроредицата и да търси проявата на гени, той добавя ДНК от ракови клетки, за да създаде профил на генетичното разнообразие, представено в туморите. Много видове рак се причиняват от хромозомно пренареждане, каквото може да стане, когато сегменти от дадена хромозома се дублират непреднамерено и това доведе до прекалено голям брой гени, кодиращи стимулиращи растежа белтъци. Други видове рак възникват поради загубата на гени, кодиращи отговарящи за потискането на клетъчния растеж протеини. Когато се прилага техниката на Уиглър, се взема биопсия както от ракова, така и от нормална тъкан на пациента. ДНК от раковата тъкан се боядисва по химически начин с червена боя, а ДНК от нормалната тъкан — със зелена. ДНК микроредици, съдържащи всичките 35 000 известни човешки гени, се излагат на контакт със смес от двете мостри. Подобно на информационната РНК в стандартния експеримент с микроредици, маркираните молекули ДНК се свързват базова двойка за базова двойка към допълващите ги последователности в редицата. Умножените гени в раковите клетки се маркират от червени петна (тъй като с това място се свързват много повече оцветени в червено, отколкото в зелено молекули), докато заличените в раковите клетки гени излизат като зелени петънца (тъй като там няма червено оцветена молекула, която да се свърже с тях). Тези опити вече увеличиха значително списъка от гени, допринасящи за поява на рак на гърдата.

Винаги когато изследваме конкретно човешко заболяване, осъзнаваме, че действаме на тъмно. Бихме могли да се движим значително по-бързо към сърцевината на проблема и да научим точно какво не е както трябва и как бихме могли да се справим с него, само ако имахме по-детайлни познания за начина, по който се изявяват гените, когато всичко е наред. При напълно оформено разбиране на динамиката на нашите гени, на това как всеки един от нашите над 35 000 гени функционира при нормалното развитие от оплодена яйцеклетка до възрастен организъм, щяхме да разполагаме с база за сравнение, чрез която да си изясняваме всяко заболяване: несъмнено се нуждаем от пълен човешки „транскриптом“. Това е следващият свещен Граал на генетиката, следващото мащабно проучване, нуждаещо се от огромни средства. На първо време най-вероятната и също толкова важна цел е получаването на пълния транскриптом на мишката, чието голямо предимство пред хората е, че можем както да наблюдаваме, така и да се намесваме експериментално по време на вътреутробното развитие. Дори събирането на свързаната с това информация от мишката ще изисква огромни инвестиции, както на пари, така и на време. А, както доказва опитът ни със секвенционирането на ДНК, за всички ще бъде по-добре да посветим време за получаването на колкото се може по-голям опит и знания от създаването на транскриптомите за по-прости организми, преди да се заемем с мишия, да не говорим за човешкия.

Изследванията на изявите на гените с микроредици по време на клетъчния цикъл на дрождите вече разкриха изумителната сложност на молекулярната динамика, характерна дори само за клетъчното делене. Участват повече от осемстотин гени, като всеки се включва в действие в точно определен момент от клетъчния цикъл. Тук може би отново ще открием характерното за еволюцията нежелание да поправя нещо, което не е развалено: веднъж еволюирал успешно, даден биологичен процес най-вероятно ще продължава да използва същите основни молекулярни актьори, докато има живот на Земята. Въз основа на това, което знаем засега, сме склонни да мислим, че същите белтъци, които управляват развитието по време на клетъчния цикъл на дрождите, изпълняват подобна роля и в човешката клетка.

Крайната цел на трите „-омики“ (ген-, проте-, и транскрипт-) е да се създаде цялостна, детайлна картина до нивото на отделната молекула за начина, по който се създават и оперират живите организми. Както видяхме, дори при най-простите случаи сложността е главозамайваща и, въпреки забележителния напредък през последното десетилетие, остават множество обезкуражаващи предизвикателства. Когато става въпрос за сложните организми, молекулярната основа на развитието — на това изключително пътуване от яйцеклетка до възрастен индивид, управлявано от линейна кодираща верига, съставена само от четири букви — засега може да бъде разбрана най-добре в случая с плодовата мушица.

Мушицата е фокус на интензивни генетични проучвания още откакто бе избрана от Т. Х. Морган и през последвалите години на непрестанни нововъведения, Drosophila melanogaster си остава генетична златна мина. В края на седемдесетте години на XX век, в европейската лаборатория по молекулярна биология в Хайделберг, Германия, Кристиане „Жани“ Нюслайн-Фолхард и Ерик Уишауз започват изключително амбициозен проект, свързан с плодовата мушица. Използват химикали, за да предизвикат мутации, и после търсят нарушения в най-ранния ембрионален стадий в потомството на плодовата мушица. По традиция търсенията на генетиците във връзка с плодовата мушица са съсредоточени върху засягащите възрастните организми мутации, като откритата от Морган, водеща до белия (вместо червения) цвят на очите им. Нюслайн-Фолхард и Уишауз се обричат не само на многогодишно напрягане на очите в резултат на взирането в микроскопа, за да търсят неуловимите мутанти, а и поемат в една напълно неизвестна посока. Отплатата обаче е забележителна. Анализът им открива няколко поредици гени, трасиращи основите на телесния план на развиващата се ларва.

По-универсалното послание на тяхната работа е, че тази генетична информация е йерархично организирана. Нюслайн-Фолхард и Уишауз забелязват, че ефектът при някои от техните мутанти е извънредно всеобхватен, докато при други — значително по-стеснен; оттук те правят правилния извод, че мащабно въздействащите гени оперират в ранния стадий на развитие — на върха на превключващата се йерархия, докато тези с по-ограничено въздействие оперират по-късно. Те откриват водопад от фактори на транскрипцията: едни гени превключват и предизвикват действието на други гени, които от своя страна след това включват други и тъй нататък. Действително йерархичното включване на гени от този тип е ключът към строежа на сложните тела. Произвеждащият биологичния еквивалент на тухла ген ще произведе купчина тухли; при правилна координация обаче, ще съумее да изгради стена и после — сграда.

Нормалното развитие зависи от това дали клетките „знаят“ къде е тяхното място в дадено тяло. Клетката на върха на крилото на мухата би трябвало да се развива по съвсем различен начин от своята посестрима, разположена в участъка, който ще изгради мозъка. Първата част от жизненоважната позиционна информация е най-простата: как разбира развиващият се ембрион на плодова мушица кой край кой е? Къде би трябвало да се изгради главата? Бикоидът, произвеждан от ген в майката белтък, се разпределя с различна концентрация в зародиша. Ефектът се нарича „концентрационен градиент“: нивото на протеина е най-високо при главата и намалява колкото по-назад се отива. По този начин концентрационният градиент на бикоида инструктира всички клетки в ембриона къде се намират по оста глава-опашка. Развитието на плодовата мушица се осъществява на дялове, тоест тялото е организирано на отделения, които имат много общи неща, но всяко от тях се отличава и с уникални за него характеристики. В много отношения главовият дял се изгражда също като дела на торакса (средната част от тялото на насекомото), но главата има специфични за нея органи като очи, а тораксът — характерни за него, като крака. Нюслайн-Фолхард и Уишауз откриват групи гени, които уточняват характеристиките на различните дялове. Например, едни гени кодират факторите на транскрипцията — генетичните превключватели, изразени в редуването на дяловете. Мутациите в тези гени водят до проблеми в развитието на всеки втори дял в зародиша.

През 1995 година Нюслайн-Фолхард и Уишауз получиха Нобелова награда за физиология или медицина за своята пионерска работа. За разлика от повечето лауреати, и двамата останаха активни лабораторни учени — те не са в състояние да се оттеглят в окичен с дипломи офис. За Уишауз науката си остава все така неустоимо привлекателна: „Тъй като зародишите са красиви, а клетките вършат забележителни неща, продължавам да ходя ежедневно в лабораторията с огромен ентусиазъм“. През детството си, преминало в Бирмингам, Алабама, той мечтае да стане художник. Притиснат от финансова нужда като студент в университета „Нотр Дам“, той се захваща може би с „най-миризливата и черна“ работа в научната сфера: приготвянето на „храна за мухи“ (нездравословен желатиноподобен буламач, състоящ се предимно от меласа) за експерименталната популация от плодови мушици за една изследователска лаборатория. Повечето хора, работили като главни готвачи за неколкостотин хиляди мръсни и неблагодарни насекоми най-вероятно биха развили доживотно отвращение към тези създания. За Уишауз резултатът е точно обратен: посвещаване за цял живот на плодовата мушица и загадките около нейното развитие.

Родена в артистично семейство, Нюслайн-Фолхард е сред студентите, които имат превъзходни резултати във всичко, което ги интересува, но не полагат абсолютно никакви усилия във всичко останало. Усилната й работа по изясняването на генетиката на развитието на плодовата мушица е достатъчно постижение за кариерата на двама, но след получаването на Нобеловата награда тя насочва вниманието си към развитието на съвсем друг вид — рибата-зебра; тази работа обещава да отключи много от тайните на развитието на гръбначните животни. През 2001 година, на честването на стогодишнината от учредяването на Нобеловата награда ме порази фактът, че беше единствената жена, присъстваща сред тълпите сивокоси мъже. Действително тя е една от десетте жени, получили Нобелова награда в областта на науката.

Един от тези вече не млади мъже беше Ед Луис от Калтек, стар познайник с плодовата мушица, поделил наградата с Нюслайн-Фолхард и Уишауз. Луис всъщност не отговаря особено на сивокосия стереотип: макар да беше прехвърлил осемдесетата си година по време на споменатото събитие в Стокхолм, когато не се налагаше да носи костюм, често можеше да го видим по анцуг! Той също отдавна се вълнуваше от генетичния контрол над развитието на плодовата мушица, но специалният му интерес бяха хомеотичните мутации. Те водят до извънредно странен резултат: един от развиващите се дялове погрешно приема идентичността на някой съседен дял. Дългогодишното му търпеливо посвещаване на Хокс гените, при които се случват тези мутации, е пример за ценностна система, която изчезва в епохата, когато научната работа често се води от модните увлечения.

Хомеотичните мутации, които, както вече се знае, влияят върху кодиращите факторите на транскрипция гени (генетичните превключватели), могат да имат драстичен ефект. „Антенопедийната“ мутация води до израстване на крака там, където би трябвало да се намират антенките на мушицата: напълно оформен чифт крака, излизащ от челото. „Битораксната“ мутация е почти толкова странна. Нормално единият от дяловете, образуващи торакса, произвежда чифта криле на мушицата, докато следващият тораксен дял, по-близо до опашката, създава чифт малки стабилизиращи структури, наречени „halteres“. При битораксната муха този дял погрешно произвежда крила, така че вместо две, мушицата има четири криле, като втората двойка е също така съвършено оформена като първата.

Когато функционират както трябва, регулиращите дяловата идентичност гени осигуряват създаването на съответните органи от всеки дял на тялото: главовият дял формира антенките, а тораксовият — крилата и краката. В случай на хомеотични мутации обаче, настъпва объркване на дяловата идентичност. Така, в случай на антенопедия, главовият дял се взема за тораксов и произвежда крак вместо антенка. И, макар и да не се намира където трябва, кракът е безупречен. Извод: Определящият мястото на даден орган ген включва цяла поредица от гени, в случая — произвеждащи антенките или, при анормално развитие — произвеждащи краката; координацията вътре в поредицата обаче не се нарушава, дори когато гените бъдат активирани не където и не когато трябва. Тук отново виждаме как намиращите се високо в йерархията на развитието гени контролират съдбата на много, много други гени по-надолу по стълбицата. Както знае всеки библиотекар, йерархичната организация е ефикасен начин за складиране и извличане на информация. При нея изненадващо малък брой гени могат да доведат нещата невероятно далеч.

 

 

Сега, когато навлязохме в новата ера на разбиране в биологията, породена от осъществяването на някога немислимия подвиг на Проекта за изучаване на човешкия геном, може би изглежда необяснимо, че се движим по самия ръб на една от следващите граници — генетиката на развитието, пак с помощта на плодовата мушица. Ние обаче няма къде другаде да отидем освен обратно в бъдещето, защото, дори с целия човешки геном в ръцете, за нас си остава загадка по каква програма се осъществяват неговите инструкции. В крайна сметка ще научим сценария на човешкия живот така добре, както познаваме сценария на мухата. Ще се разработи обемно описание на схемата на изява на човешкия ген (транскриптома). Ще се направи пълен инвентар на всички наши протеини (протеома). И ще разполагаме с пълна и впечатляващо сложна картина за начина, по който е създаден всеки един от нас и как всяка една от безбройните молекули, от които сме съставени, фигурира в моето и вашето функциониране.